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2015

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Nature:一场“细胞”引发的风波


  当干细胞研究领域曾经备受赞誉的“突破性进展”的真相在今年上半年被最终揭露之时,许多人士开始提出这样的问题:“科学界到底应该采取哪些措施来避免此类问题的发生?”那是一个太过美妙以至于显得很不真实的故事——结果证明那的确不是事实。最终,两篇报道了干细胞生物学领域内重大突破成果的文章在7月2日被撤回,留下的,是科学界沸沸扬扬的争议与讨论,以及数位日本研究学者被损毁的声誉。 

  这场风波引得全世界的科学家不由又回想起了发生在十年前的一宗学界丑闻。2004年2月,韩国科学家黄禹锡(Woo Suk Hwang)宣布他成功地从克隆人胚胎中获得了干细胞株,这意味着人们可以获得各种类型用于治疗的人体细胞,这些细胞在遗传上可与任何患者相匹配,而避免了被患者免疫系统排斥的问题。这一成果立刻引起了干细胞领域前所未有的瞩目,人们对其应用前景兴奋不已。然而,当最终发现上述研究成果均为伪造时,媒体再一次暴风骤雨般地席卷了科学界。两篇主要论文被撤回,数位相关科学家的职业生涯被葬送。事件过后,科学家们不约而同地开始反省,“科研诚信”变成了热门话题。研究者们开始重新思考论文作者所肩负的责任,以及那些许诺要更好地对员工进行监管的科研院所的责任。包括《自然》(Nature)在内的期刊杂志也纷纷表态,将对来稿进行更加仔细的审查。Nature在当时一篇社论中这样写到:“永远要记住,意义非凡的研究成果需要非同一般的证据予以核实。” 

  在那之后一年,俄勒冈医科大学(Oregon Health & Science University)的Shoukhrat Mitalipov宣布从猴子获得了克隆胚胎干细胞。Nature要求他用独立试验来证明那些细胞株来自猴子供体。这一证明性的结果与其克隆相关的论文一起发表了。“我很赞成他们的做法,”加州再生医学研究所(California Institute for Regenerative Medicine)所长Alan Trounson这样说,他也参与了上述独立试验。接下来,就出了日本这桩干细胞研究事件。今年一月,来自日本理化研究所(RIKEN)发育生物学中心(Center for Developmental Biology,CDB)的年轻生物学家小保方晴子(Haruko Obokata)在Nature上发表了文章,报道了她将小鼠细胞置于物理压力或暴露于酸性环境中,就可将其诱导成为胚胎干细胞样细胞的发现。该诱导过程被称作刺激触发性多能性获得刺激触发获得多能性(stimulus-triggered acquisition of pluripotency, STAP),与以往干细胞研究所得到的理论与结果截然不同,有些科学家声称,他们难以相信这一结果,但看到小保方晴子的共同作者的鼎鼎大名——在干细胞研究与克隆领域最具权威的人物,他们才勉为接受。

  但是,小保方晴子的文章很快被发现漏洞百出:在其文章中,有抄袭片段;所使用的结果图也被发现有人为处理过的痕迹,有些图像似乎被反复使用,却用于解释不同的实验结果。更恶劣的是,通过遗传分析发现,实验中所使用的细胞并非文章中所申明的细胞。此外,尽管采用STAP诱导产生胚胎干细胞在文中被描述成相当简单的方法,但到目前为止,还没有人能够重复这项实验结果。 

  在接下来的六个月时间里,小保方晴子被其所属的研究机构认定为学术不端;包括日本理化研究所所长野依良治(Ryoji Noyori)在内的数位备受尊敬的科学家,面对公众鞠躬道歉;两篇发表于Nature上的论文也被撤回。最终,当人们发现STAP细胞的相关证据是如此劣质时,评论家们不由发问:“在黄禹锡事件之后,科学界所承诺过的严谨慎重,对实验证据的高标准要求到哪里去了?” 

  这一事件再一次引发科学界对科研质量、同行评审制度,以及共同作者、研究机构和杂志所共同担负的责任等问题的思考。同时,从这一事件中,也让科学从业者学习到科学研究工作中不可触碰的底线在哪里。斯克里普斯研究所(Scripps Research Institute)的干细胞生物学家Jeanne Loring说,上述案例已经成了其实验室的经典寓言,是学生们学习科研工作道德规范的现实教材。  

  Nature的新闻部与期刊部是相互独立的两个部门,期刊部负责评审并发表了STAP论文。在本文中,新闻部将对这一时间进行调查,旨在寻找错误的根源在哪里,以及人们能从中学到些什么。

 

  科学研究中的转折 

  有关STAP假说的争论其实已经有十几年之久。Charles Vacanti是位于波士顿的布莱根妇女医院(Brigham and Women’s Hospital)的一位麻醉医生,2001年,他宣称发现在几乎所有类型的哺乳动物组织中都存在着“芽孢样细胞”。Vacanti认为这些细胞具有多能性——也就是说它们可以生长成为任何类型的机体细胞——而且在正常情况下处于休眠状态,可能在创伤或疾病状态会被激活,从而修复受损组织。  

  Vacanti在今年一月Nature新闻部的采访中表示,早在2006年,他的实验室就已经可以培养大量上文提到的芽孢样细胞,但是却未能获得细胞的多潜能性。之后,他把这项研究工作交给了小保方晴子,一位于2008年加入其实验室的研究生。 

  在细胞多潜能实验中,往往需要将细胞注射进正在发育的小鼠胚胎——构造一个“嵌合体”——然后追踪其进程。这项实验并不简单,小保方晴子需要协助。“我想上天祈祷,能够顺利进行实验,”她在一月如是说。她在互联网上了解到CDB的若山照彦(Teruhiko Wakayama)是一位很有名望的小鼠克隆专家。于是,在2011年,小保方晴子以访问学者身份进入若山照彦的实验室。起初,他们使用成年小鼠细胞进行实验,在经历了不计其数的失败后,他们开始转而使用新生小鼠细胞——这一次他们成功了。 

  在那时,若山照彦和小保方晴子都坚信,分离过程中产生的应激状态促使多潜能细胞的产生。小保方晴子表示,那个点子是她在泡澡的时候突然想到的,同时也让她想到自己生活中面临压力时的状态。 

  在RIKEN进行实验期间,她采用酸浴的方法使新生小鼠的脾细胞处于应激状态。她还进一步进行了相关实验,检测细胞的转化,这些实验是与CDB的两位备受尊崇的干细胞生物学家"    林佳树佐才(Yoshiki Sasai)及丹羽仁史(Hitoshi Niwa)共同合作的。在实验中,他们发现STAP细胞有两大显著特性——多潜能分化以及可在应激条件下被诱导产生——小保方晴子已经具备足够的数据,最终在2014年1月30日出版的Nature杂志上发表了两篇相关论文。 

  小保方晴子因此一夜成名,成为日本科学界一颗璀璨的新星。媒体争相对其进行报道,其中不乏许多关于这位美女科学家的日常小细节。比如在她的实验器材上可以看到可爱的“moomin”卡通贴纸,又或是她在实验室里不穿白大褂,而是身着她的奶奶送给她的传统日本围裙。这些无疑都为这位科学新星赢得了公众更多的好感。 

  然而,短短几周之内,便开始有不知名的评论家们对论文中的错误产生质疑,包括对图片的人为操作、重复使用,以及抄袭其它论文片段等。同时,也有研究者开始表示他们无法重复所谓“很简单”的实验结果      

  今年4月1日,RIKEN的调查委员会宣布认定小保方晴子有学术不端行为。小保方晴子依然坚称实验结果是真实的,但是接下来,她论文的共同作者相继表示收回对其研究结果的支持态度。原则上而言,Nature只有在所有共同作者都同意的情况下才会撤回文章,但在少数情况下,也会出现即使有一人或多人有异议时,仍然撤回文章的情况。今年6月,小保方晴子做出让步,同意撤回两篇文章。自4月开始,她没有接受任何采访。她被要求参与正在RIKEN进行的原始数据验证实验——当然,是在监控条件下进行。 

  也有人开始质疑,这样的文章为何会被发表呢?有批评者指出,在Nature发表这两篇文章之前,就有很多疑点应该被注意到。尤其是在其文章中,使用了长达17行的文字,几乎是一字不差的来源于另一研究小组发表于2005年的一篇文章。 

  为了检测文章是否有抄袭现象,绝大部分期刊使用CrossCheck服务。它可以将文章与来自100,000个不同期刊的大约4千万已发表文章进行对比,通过文字匹配程度,识别抄袭现象。 

  事实上,在审查小保方晴子的文章时,Nature的编辑也的确使用了CrossCheck,但并未发现匹配文字。原因在于,该文字来源是名为In Vitro Cellular & Developmental Biology — Animal的杂志,当时并未在CrossCheck索引范围中。“尽管数据库的确容量浩大,而且还在不断更新,但是依然是有局限性的,”CrossRef的产品经理Rachael Lammey解释道。位于英国牛津的CrossRef是CrossCheck的服务供应商。Rachael Lammey说,这样的遗漏每年会增补几次,但是仍然没有办法知道会有多少抄袭情况成为漏网之鱼。 

  此外,即使发现有文字匹配现象,也并不能真正妨碍文章发表。绝大部分此类情况并不构成抄袭行为,而只需作者将原文索引标注出来即可。RIKEN的调查委员会也同样表示,那段17行的引用文字应该说明出处,但没有这样做,也并不能认定作者就是学术不端。 

  事实上,真正让委员会头疼的事STAP论文中那些重复使用,以及进行过人为处理的图像。小保方晴子把不同实验中的电泳结果拼接在了一起,冒充结果来自同一实验。此外,她还使用了一副畸胎瘤细胞的图片,畸胎瘤是一种包含多种组织类型的肿瘤,那副图片曾经在她的博士学位论文中就使用过。而图片标题表明,她使用了同一个图片,但却用来代表不同类型的细胞。调查委员会认为,对于这两种情况,可能她并非是完全故意要这样做的,但她理应有基本常识应该认识到其中的问题,因此最终认定她学术不端。而小保方晴子则坚持上述问题只是不小心而导致的错误,拒绝承认是学术道德问题。

 

  文章图片的使用 

  在同一文章中的图片处理及重复使用问题是可以被审查发现的,越来越多的期刊发现这一问题的存在。Jana Christopher会对每篇文章中的图片进行分析确认,文章才会被EMBO Press接收。EMBO Press是位于德国海德堡的一家期刊杂志出版商。她使用经过一系列调整的图像处理软件Photoshop对论文图片进行分析,软件调整是由美国科研诚信办公室(US Office of Research Integrity)所提供的,对软件性质进行了一些改动,例如对比度、色度等,以便更容易地发现图片人为处理的情况。  

  EMBO Journal的主编Bernd Pulverer任命Christopher在不知事件背景的情况下,对STAP论文结果进行检测。她发现了三个主要问题:第一,电泳图的人为处理最终被定论为学术不端;第二,看似无心之举地重复使用了图片,被认为是失误;第三,把细胞克隆的图片合成在一起,最大的可能是为了节省篇幅。  

  Pulverer说:“我们发现的问题都很典型。”他报道说,自从2011年,期刊开始对文章进行此类问题审查后,大约有20%的文章都会出现类似问题。位于纽约的洛克菲勒大学出版社出版的《细胞生物学杂志》(The Journal of Cell Biology, JCB),自2002年起,已经开始对所有接收文章进行系统审读,得出的问题概率是类似的。 

  但是,期刊方并未立刻意识到看似是伪造图片行为背后的其它问题。将电泳凝胶不同泳道的图进行拼接,有时只是为了把数据结果呈现得更加清晰、准确。大部分情况下,对图片的处理,只是出于为了使其“更美观”、传递更丰富的信息等这样单纯的动机,Pulverer说。“但是,如果关于图片处理的解释显得并不可信,或者原始数据有可能存在问题时,我们会做更多地验证。”对于JCB而言,被接收的文章中大约有1%的文章会被撤回,杂志的执行编辑Liz Williams介绍说。 

  这样的审读机制并不轻松。也有些人担心当期刊杂志指出有哪些问题是不被允许的时候,这无形当中也是在帮助那些想要学术作假的人提高他们的造假水平。此外,尽管图片处理的现象容易被发现,图像的重复使用则不那么容易被鉴别,尤其是当它们来自其它文章时。“跨文章比对需要高性能的搜索算法,有可能还需要一台超级计算机,”Pulverer说。“这个话题已经讨论了很多年,但始终没有什么进展。”在STAP这个案例中,目前采用的图片检索程序不可能发现作者所使用的畸胎瘤的图像,其它一些经过更加严格审查才水落石出的问题也不大可能经由这一程序发现。 

  Nature的主编Philip Campbell说:“我们认为不大可能事先觉察论文存在的所有问题。”但是科学家及出版方一致认为,如果能够抓住即使不那么严重的错误,就有可能为人们敲响警钟,随之而来的进一步的审查,可能会发现存在的更加严重的问题。 

  很多人认为Christopher所进行的检测应该应用于所有文章。而Christopher则说,她需要花费三分之一的工作时间,对EMBO Press出版的四个杂志的接收文章进行审查。Nature和Nature research杂志采用随机抽查图片的方法进行检查。Nature发言人Alice Henchley说,杂志并未对所有文章的图片进行审查,原因在于资源的有限,而STAP就恰好是“漏网之鱼”。她补充道,在除了这件事之后,编辑们已经决定要提高Nature论文的审查数量。不过,需要审查的文章的具体比例,还依旧在讨论中。” 

  对于具有突破性进展的研究成果,只是对文章的图片和文字进行审查,是不足以证实其研究结果的真实性的。经独立遗传检测证实,世界上第一个克隆羊多莉(Dolly)在遗传学上与其克隆来源乳腺细胞相一致。而出自黄禹锡实验室的第一只克隆狗Snuppy,也经过了独立遗传检测的分析。两项验证实验都在首批实验结果发表后就展开了,以便平息其所导致的争论。但是,类似的验证工作也可以在文章发表前进行,从而避免争议的出现。  

  Nature在2007年迈出了这一步,他们向Mitalipov要求对猴干细胞株进行独立检测,最终证明了那些细胞的真实性。那些检测需要研究者间进行协调合作,在不同的地方却要采取完全一致的标准。“这个过程持续了数月之久,” Mitalipov.说。后来,他选择了另一家期刊,《细胞》(Cell),发表了他另一篇重要的干细胞克隆的文章——这一次,使用的是人类细胞——部分原因就是由于Nature进行独立检测的繁琐过程。这篇文章在被接收12天后就发表了。有批评者指出最后定稿中也存在着图片重复使用,以及被错误标记的图表等问题,但是作者最终证明了那些都是无伤大雅的小错误。 

  一些研究者指出,如果课题合作者们在提交他们的论文给杂志之前,能够进行更加严格的验证,是很重要的——想必关于这一点,若山照彦已经从惨烈的现实中学到了。在STAP案例中,如何做到这一点并不十分明了。和羊、狗或者灵长类动物不同,遗传学上相同的小鼠细胞系以及相匹配的胚胎干细胞株很容易获得,因此很容易利用这一点伪造实验结果。“我们没有办法从遗传学上对来源于同一细胞系的胚胎干细胞和STAP细胞进行鉴别,” 来自怀特黑德生物医学研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research)的干细胞生物学家Rudolf Jaenisch说。  

  接下来所进行的遗传分析最终似乎揭示了STAP案例的真相。今年3月,随着论文被质疑的问题越来越多,若山照彦开始请第三方对据称是STAP细胞的样品进行基因测序分析。该分析主要集中于一个特性——编码荧光蛋白的基因序列位于基因组的哪个区域,以此来确定细胞的来源。最终结果显示,这些细胞并非来自论文中所宣称的小鼠。 

  在遗传验证之外,还可以通过实验是否可以重复,来判断实验结果的可靠性。当然,这对于科学家而言可能是一个不大近情理的负担。但是,来自安德森癌症中心(MD AndersonCancer Center)的发育生物学家Richard Behringer认为,可以通过询问作者,其实验室是否有其他人获得了同样的实验结果,从而确保所有数据及图片更加可靠。 

 

  实验结果的可重复性 

  Nature并未透露在这一事件过程中,编辑与文章作者之间的沟通内容,但是,Campbell说,一共有四个独立小组,对两篇文章进行验证。当关于STAP细胞的文章开始被质疑时,文章的共同作者坚称他们对文章的可重复性实验进行了监督。Sasai宣称他的实验室观察到了STAP细胞的产生。但事实上,他只是让小保方晴子重复了STAP过程的第一步——表达Oct4蛋白——他当时拍下了这幅图片。真相败露之后,他解释说,“当时没有考虑到他所看到的那些细胞与STAP干细胞进一步的派生之间还有很大一段路要走。”诺贝尔奖获得者及日本理化研究所(RIKEN)所长野依良治(Ryoji Noyori)就STAP研究中的错误行为表示道歉。 

  若山照彦称,他“独立”重复实验,获得了看起来与胚胎干细胞极为相似的STAP干细胞——这比Sasai的工作貌似更进了一步——正是这一点让他相信这个方法是可靠的。在文章被质疑之时,他通过电邮告诉Nature的新闻部:“我在RIKE对该方法进行了独立检测,因此,我相信这个结果绝对是真实的。”现在回想起来,想必他已经明白,他的重复实验并非完全是独立进行的——小保方晴子在他进行实验时一直伴其左右,并观看了每一步。由于在进行那次检测后不久,他就前往日本山梨大学(University of Yamanashi)就任新职,因此,他也就没有对细胞进行鉴别,或者对接下来的实验进行监管,不知是否有人对其做了改动或者样品被污染。RIKEN调查委员会最终认定,尽管Sasai和若山照彦并未构成学术不端,但对于此次事件的发生负有不可推卸的主要责任。 

  在所有文章的共同作者中,对实验可重复性问题造成最大迷惑的是Vacanti。就在STAP文章发表后一周之内,他给《新科学家》(New Scientist)寄送了声称是人STAP细胞的图片。尽管其他人都没能成功重复STAP实验,他在二月中旬接受Nature新闻部采访时说“这真的不是那么困难,如果我能对实验进行重复,别人应该也可以。”三月中旬,他在网上贴出了一系列有关如何生成STAP细胞的方法,“无论你研究的是何种细胞”。然而,事到如今,他却无法拿出足够的证据证明他的实验室曾经成功获得了STAP细胞。Vacanti在7月2日发表的一份声明中称,尽管他同意稿件由于一些错误被撤回,但他相信STAP的“核心概念一定会被RIKEN以及其他研究组独立验证成功。  

  对于许多干细胞研究者而言,STAP所引起的风波中最令人震惊的是,Niwa、Sasai和Wakayama这样的科学家也被卷入其中。“像他们这个级别的共同作者,应该明白,他们必须确保实验结果是可以被独立重复出来的。因此,在这件事情上,他们理应承担相应的责任,”来自新加坡医学生物研究所的发育与干细胞生物学家Davor Solter这样说到。  Wakayama为自己的疏忽感到自责,他认为自己应该对小保方晴子的工作进行更多地检查,例如她的实验笔记等。事实上,调查委员会发现其笔记本的内容十分混乱。 

  也有一些人们对被卷入此次风波的研究者们表示同情,认为他们自己也是被欺骗的,而且还是被一个年资尚浅的前辈由于疏忽或者有意地欺骗了。“在科学中,应该有控制与监督,但是更重要的是信任,否则,整个体系就会崩解,” 分子生物学家Maria Leptin说,她同时也是EMBO主任。“我不可能对实验的每一个诸如用滴管取样这样的细微步骤进行监管,监督并不是重点。” 

  除了共同作者的疏于监督之外,来自加拿大多伦多儿童医院(Hospital for Sick Childrenin Toronto)的干细胞研究者Janet Rossant将矛头指向了Nature杂志本身。她认为Nature在对文章进行审查和校订时,不够负责,“他们根本没有想要去进行验证,再决定文章是否发表。” Janet Rossant也是国际干细胞研究协会(International Society for Stem Cell Research)的负责人。Campbell对这种指责予以否认:“Nature并未放低评审的标准。” 

  有些人建议期刊杂志可以将审稿人的评语一起公开发表,使整个文章发表过程更加清晰。Campbell表示,他们考虑过这个做法,但同时也有一些问题,例如可能会出现的错误解读,审稿人不希望将其评语进行发表等。这些都阻碍了真正执行这个措施。

  “我们必须接受这样一个现实:有科学研究之处,就有可能出现学术不端之行为,” 来自澳大利亚墨尔本大学的科研诚信顾问Paul Taylor这样说。科研院所对科研人员进行必要的培训,并努力提高数据管理的基础设施也是一个方面,“但是,没有任何政策、教育、培训、行政命令能够百分之百避免学术造假行为。” 

  Taylor说,我们还应该看到,面对此类事件,相关人士所属的研究所如何回应,也是需要引起关注的。从这个角度看,STAP事件算是一个经典标杆。RIKEN承认了其在数据管理方面存在的漏洞,在STAP论文发表方面,也存在着对媒体夸大其辞的行为。Taylor认为RIKEN面对问题的反应是快速、有效、透明的。在对小保方晴子的研究工作进行调查期间,Noyori要求RIKEN的所有实验室对其发表文章进行同样的审查,以确定是否存在同样的错误,那意味着成千上万的文章需要被验证。 

  在干细胞研究学界,STAP事件成为继黄禹锡之后又一个警戒后来者的故事。在Loring看来,这个故事让她学到了在研究工作中,做好记录以及谨慎参与合作的重要性。“我告诫实验室所有成员,作为文章作者,就要对研究成果的真实性负起全部的职责。那时我们赖以生存的基础。”她说她已经将自己的名字从共同作者名单上去掉,以避免有些情况下,她无法保证文章质量,从而出现的问题。  

  对于绝大部分人而言,这是一个令人印象深刻的教训。“在科学界,名誉就是一切。一旦失去,想要重新获得,就十分困难了。” Trounson说。

 

(本文章摘自2015-2-5《干细胞之家》)